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    支原體污染常用檢測方法
    來源:新浪博客上海炎熙生物| 更新時間:2018-06-05
         支原體(mycoplasma):又稱霉形體,在分類學上是處于細菌和病毒之間的一種微生物,是目前發現的最小的最簡單的原核生物。支原體細胞中唯一可見的細胞器是核糖體。支原體直徑一般在0.2-0.8 ?m之間,呈高度多形性,有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態。支原體缺乏細胞壁,有變形能力,能通過濾菌器、可在無生命培養基中生長繁殖,在自然界分布極為廣泛?蓪θ、動物、植物、昆蟲等治病,造成極大危害。
        支原體是細胞培養中常見的一種污染源。細胞培養中的支原體污染可能來自培養基、血清或實驗操作者,會影響細胞生長率、細胞形態、基因表達、細胞代謝和細胞活力。

        支原體對細胞的影響,主要從兩方面考慮:一方面是對細胞的直接影響,細胞被支原體污染后,增殖緩慢,部分細胞變圓,從瓶壁上脫落,部分細胞雖然表面變化不十分明顯,實際上潛伏著多方面的危險;另一方面,支原體可以通過消耗培養基中的精氨酸,抑制細胞DNA、RNA的合成,降低細胞的抵抗力?偟膩碚f,支原體污染對細胞造成的影響是多方面的:包括代謝、免疫或生化特性、生長狀況、酶的作用途徑、細胞膜的組成、染色體結構、轉染效率、以及細胞存活等多方面的改變。

        支原體能輕易地通過標準濾膜,同時也能拮抗絕大多數的抗生素。而且,支原體污染細胞后,培養液可不發生混濁,多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著,細微變化也可由于傳代、換液而緩解,因此易被忽視。因此,在細胞培養過程中,對支原體的防范、檢測和去除非常棘手,也非常重要。

        污染實驗室培養細胞的支原體主要有八種,通常用于細胞培養的絕大多數抗生素都對其無效。例如青霉素主要作用于細菌細胞壁,但支原體沒有細胞壁因此就不受影響。無懈可擊的細胞培養技術始終是預防支原體污染的最佳方式,另外及時找出受到支原體污染的培養物也很重要,這樣才能在污染擴散前快速采取有效措施。以下就為您介紹幾種在細胞培養中檢測支原體的常用方法。

    1,  分離培養法

        分離培養法是支原體檢測的金標方法,其檢測精確度最高。這種方法是從可疑的細胞培養體系中取樣,并接種到最適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體,它們就會在這種瓊脂平板上瘋狂生長,最終形成明顯可見的特征性菌落。分離培養法基本不會出現假陰性結果,因此被譽為支原體檢測金標準。不過分離培養法也存在兩個弊端,一是檢測時間太長,支原體要長出明顯克隆至少需要4周時間。二是盡管可以檢測絕大多數支原體種類,分離培養法也有力所不及的時候,例如支原體M. hyorhinis尚不能在體外進行培養,因而不能使用這個方法。

        如果你實在不想等這么久,或者希望在分離培養法的等待過程中先拿到初步結果,你可以試一試DNA、PCR或酶學檢測方法。不過需要注意的是,上述檢測方法都不能單獨檢出所有類型的支原體,而且靈敏度也沒有分離培養法高,所以最好結合使用兩種方法以獲得最可靠的檢測結果。

     

    2,  熒光法DNA檢測

        熒光法DNA檢測一般需要幾天時間。將可疑樣品與指示細胞共同培養,DNA檢測所用的指示細胞通常是細胞質區域較大的Vero細胞,如果原樣本中含有支原體,那么當細胞DNA被熒光染料(如Hoechst染料)染色時,就可以在指示細胞核周圍以及細胞膜周圍、培養基中觀察到熒光斑點或熒光顆粒。分離培養法用來檢測支原體M. hyorhinis菌株并不可靠,而DNA法可以準確的將其檢測出來。這個方法的缺點是死亡細胞釋放出來的DNA會造成很大干擾,使得判斷誤差發生率大約在30%左右,因此使用這個方法需要一定的經驗。

     

    3,  PCR

        PCR法可以檢測所有種類的菌株,包括M. hyorhinis菌株。PCR法檢測支原體只需幾個小時,是最靈敏的支原體檢測方法。該方法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本,其中PCR引物通常針對支原體的16S rRNA基因的保守區域。在凝膠電泳過程中,支原體DNA會顯示為特異性條帶,以此指示支原體的存在。PCR法可以檢測所有種類的支原體,快速,靈敏度最高,缺點是不能區分支原體的死活。而且因為PCR法過于靈敏,在操作過程中容易產生假陽性,所用的器具、槍頭、管壁等也都可能因為攜帶微量的支原體DNA而導致假陽性現象。

     

    4,  酶學檢測和ELISA

        酶學檢測是將可疑樣本添加到特定底物中,在這一體系內支原體的酶可以將ADP轉化為ATP,隨后能利用ATP發光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。這個方法的檢測速度最快,大概半小時即可完成,死亡的支原體不會造成干擾。缺點是靈敏度比PCR法低,而且需要的檢測發光的儀器尚未普及。

        ELISA也能用于支原體檢測,以ELISA法為基礎的支原體檢測一般使用針對支原體16S rRNA基因的帶標記探針或抗體,來檢測培養物中是否含有支原體。這個方法現在已較少使用。

     支原體定期檢測

        支原體污染會使培養細胞慢慢枯萎,因此對培養細胞定期進行支原體檢測非常重要。一般來說每13個月就應該進行一次例行支原體檢測。將定期支原體檢測常規化堅持下去,是細胞培養實驗室應對支原體污染的關鍵。對新引進的細胞系應進行檢測,防止引入外來的污染源。對于凍存的細胞,在凍存之前或者放入液氮之前進行檢測,以免以將含支原體的細胞作為種源保存。

     

    如何預防支原體污染

        支原體污染的來源包括工作環境的污染、操作者本身的污染(一些支原體在人體是正常菌群)、培養基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。

        細胞培養工作中,主要從以下幾個方面來預防支原體的污染:控制環境污染;嚴格實驗操作;細胞培養基和器材要保證無菌;在細胞培養基中加入適量的抗生素。最好的預防支原體污染的方法就是嚴格操作,避免污染。

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